1.簡介   

2017年，來自美國喬治城大學劉學峰課題組提出條件重編程細胞（Conditional reprogrammed cells，CRCs）可在實驗室中無限制培養出正常的細胞和腫瘤細胞的技術【1】。該技術是指將銫源γ射線輻照過的 Swiss-3T3-J2 小鼠成纖維飼養細胞與人正常細胞或腫瘤細胞共同培養，通過添加Rho相關蛋白激酶(Rho-associated kinase, ROCK)抑制劑Y-27632，使正常細胞或腫瘤細胞獲得部分干細胞特性和在體外無限制復制能力的一種細胞培養技術。

2.技術流程【1】

2.1飼養層細胞培養

（1）將Swiss-3T3-J2小鼠成纖維細胞培養在37°C，5%CO2培養箱，每周傳代2-3次。

（2）傳代時，用PBS沖洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室溫下孵育20 s。加入4倍體積的DMEM完全培養液終止消化。

（3）300g，離心5min。

（4）細胞沉淀重懸于10ml的DMEM完全培養液中，按照1x103細胞/cm2 細胞鋪板，置于37°C，5%CO2培養箱中進行培養。

2.2新鮮組織的運輸、處理

（1）新鮮組織在術后12小時內，無菌條件下進行運輸和處理。

（2）用95-100%乙醇快速沖洗切除的組織樣本（最多3s），然后用冷（4℃）PBS清洗后轉移到無菌培養皿中。

（3）使用鑷子和手術刀，去除殘留的脂肪組織。

（4）將組織切成小于10mm的小塊。將組織小塊置于5ml的組織保護液中，經冷鏈（2-8℃）運輸至實驗室.

2.3原代細胞分離

（1）配制10x膠原酶/透明質酸酶溶液于15ml離心管中。取F培養基和10x膠原酶/透明質酸酶混合溶液按照3:1進行混合。

（2）用95-100%乙醇快速沖洗切除的組織樣本（最多3s），然后用冷（4°C）PBS沖洗。

（3）將組織切成小于1mm3的小塊。

（4）將組織碎片轉移到含有4mlF培養基/膠原酶/透明質酸酶/分配酶的15ml離心管中，在37°C上搖晃孵育1-3小時。

（5）解離后，4°C，500g離心5 min，棄上清。將細胞沉淀重懸于10 ml完全DMEM培養液中。

（6）通過100μm的細胞過濾器將細胞懸液過濾到一個新50ml離心管中。4℃，300g離心5 min，棄上清。

2.4飼養層細胞輻照和共培養

（1）取培養至80-90%匯合度的Swiss-3T3-J2小鼠成纖維細胞，用PBS沖洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室溫下孵育20 s。

（2）加入4倍體積的DMEM完全培養液終止消化。

（3）300g，離心5min。細胞沉淀重懸于10ml的DMEM完全培養液中進行30Gy的適當輻照（采用平行培養，確保照射后J2細胞沒有增殖）。

（4）輻照后，立即將J2細胞與處理過的組織或所需的上皮細胞一起放在T25瓶中（1×104細胞/cm2），放在完全F培養基中。

（5）保持共培養在37°C，95%濕度和5%CO2培養箱中，直到匯合。

2.5差異胰酶處理共培養細胞進行傳代

（1）取共培養且匯合細胞，用PBS沖洗1次，然后用0.05%的胰酶/EDTA溶液在室溫下孵育20 s，鏡下觀察消化情況，僅保持上皮細胞克隆存在。

（2）用PBS沖洗上皮細胞，然后用1ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃下重新處理5 min。

（3）加入4倍體積的完全DMEM培養液終止細胞消化，收集混合液于15ml離心管中。

（4）4℃，300g離心5 min，棄上清。細胞沉淀加入F培養基重懸，按照一定比例進行傳代培養。

3.應用

CR 技術為細胞永生化的研究帶來了希望，在原代細胞培養、腫瘤治療等研究領域展現出了巨大的應用前景。

3.1原代細胞培養方面的應用【2】

目前CR 技術已用于肺部、乳腺、結腸、食管、包皮上皮和子宮頸陰道部及尿液脫落膀胱癌細胞的分離培養【3-5】。同時，該技術培養細胞，在成人上皮細胞中表現出干細胞特性【6】。

3.2腫瘤治療方面的應用【7】

Yuan等【8】利用CRCs建立了侵襲性復發性呼吸道乳頭狀瘤患者的正常和腫瘤肺組織細胞培養物。該研究應用基因組學分析發現喉癌腫瘤細胞含有野生型7.9-kb人乳頭狀瘤病毒11型基因組，肺腫瘤細胞含有10.4-kb基因組。進一步利

用藥物敏感性測試，確定伏立諾他胺作為特異性潛在的治療劑，臨床治 3 個月后，病灶開始縮小。

Timofeeva等【5】利用培養出的前列腺正常細胞和腫瘤細胞，證明基底細胞群作為前列腺腫瘤的主要來源，同時說明 CRCs 在飼養細胞和 Y-27632 存在的條件下可維持高水平的增殖和低水平的分化，一旦置于體內或模擬其自然環境的條件下可完全分化。研究者研究多西他賽對CRCs的敏感性，匹配的正常細胞和腫瘤細胞的IC50值分別是1.79 μm和0.29 μm，這些數據可以說明匹配的正常和腫瘤細胞可用于患者的個體化治療或者用于發現新型藥物。

黎張燕等【10】利用CRCs技術建立肺癌體外培養體系，采用MTS方法檢測6例肺腺癌細胞對臨床常規化療藥物順鉑、卡鉑、奈達鉑、長春瑞濱的敏感程度，結果顯示患者肺腺癌細胞整體對鉑類藥物敏感率高，而對長春瑞濱的敏感率低，與臨床情況具有一致性，也與之前的研究結果相似。

4.參考文獻

【1】Liu X, Krawczyk E, Suprynowicz FA, Palechor-Ceron N, Yuan H, Dakic A, Simic V, Zheng YL, Sripadhan P, Chen C, Lu J, Hou TW, Choudhury S, Kallakury B, Tang DG, Darling T, Thangapazham R, Timofeeva O, Dritschilo A, Randell SH, Albanese C, Agarwal S, Schlegel R. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nat Protoc. 2017 Feb;12(2):439-451. doi: 10.1038/nprot.2016.174. Epub 2017 Jan 26. PMID: 28125105; PMCID: PMC6195120.

【2】葉方疊,姜昊文.條件重編程培養技術體外長時程分離培養原代細胞的應用進展[J].復旦學報：醫學版, 2020, 47(5):7.DOI:10.3969/j.issn.1672-8467.2020.05.019.

【3】Ahmad,M,Alamri,et al.Primary cancer cell culture: mammary-optimized vs conditional reprogramming[J].Endocrine Related Cancer, 2016.

【4】Jensen T J , Foster C , Sayej W ,et al.Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation[J].Journal of Visualized Experiments Jove, 

【5】Timofeeva O A , Palechor-Ceron N , Li G ,et al.Conditionally reprogrammed normal and primary tumor prostate epithelial cells: a novel patient-derived cell model for studies of human prostate cancer[J].Oncotarget, 2016.

【6】Suprynowicz F A , Kamonjoh C M , Ewa K ,et al.Conditional cell reprogramming involves non-canonical β-catenin activation and mTOR-mediated inactivation of Akt[J].Plos One, 2017, 12(7):e0180897.

【7】張卉卉,俞萬鈞.條件重編程細胞在腫瘤治療中的研究進展[J].中國腫瘤臨床, 2018, 45(15):4.DOI:CNKI:SUN:ZGZL.0.2018-15-015.

【8】Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. [J].New England Journal of Medicine, 2012, 367(13):1220.

【9】黎張燕,唐欲博,羅紅鶴,等.人原代肺癌細胞體外長期培養及個體化藥敏研究[J].今日藥學, 2017, 27(2):6.DOI:CNKI:SUN:YAXU.0.2017-02-013.