1.簡介 

   間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能。 研究表明,MSCs 廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，如骨髓【1】、外周血【2】、脂肪組織【3】、羊膜和臍帶【4】、胎盤【5】、牙髓【6】、皮膚等【7】。

2.技術流程【8-9】

2.1臍帶間充質干細胞的分離培養

（1）無菌采集健康產婦剖宮產中的胎兒臍帶15 -20 cm，裝入預先放置 PBS（含 2%青霉素+2%鏈霉素）的密封容器中帶回實驗室。

（2）于實驗室超凈工作臺內，反復沖洗以除去臍帶組織表面的血凝塊，用止血鉗

（3）夾住臍帶兩端，放入 75%醫用酒精浸泡 1 min 左右。

（4）然后轉移至 PBS 中清除臍帶表面殘余的酒精,將臍帶剪成 2-3 cm 的片段，放入PBS 中，以除去臍帶動脈、靜脈中的血細胞。

（5）隨后用組織剪剪開臍靜脈,去除臍靜脈、臍動脈及臍帶外膜,分離出華通氏膠組織，PBS 反復沖洗后將華通氏膠剪成 2- 3 mm組織塊均勻鋪于60 mm 培養皿中。

（6）添加少量培養液以保持組織塊濕潤。將培養皿放入CO2培養箱，靜置12 h后，沿培養皿側壁輕柔加入少量培養液，繼續培養，每5 d換液1次。

2.2細胞增殖能力測定

（1）取培養的第4代人臍帶間充質干細胞進行細胞增殖能力的測定，用0.25%的胰蛋白酶消化人臍帶間充質干細胞，離心后去上清。

（2）加入含體積分數10%的胎牛血清的 DMEM 培養液使細胞重懸，調整細胞濃度至1x104個細胞/ml，接種于24孔細胞培養板，每孔1 ml細胞懸液。 

（3）將培養板置于CO2培養箱中，每3 d更換培養基1次。在第2，4，6，8，10，12天分別取3孔細胞，消化后用細胞計數儀進行計數。

（4）以培養時間為橫軸、細胞數量為縱軸，繪制第4代人臍帶間充質干細胞的生長曲線。

2.3細胞表面抗原檢測

（1）取培養的第4代人臍帶間充質干細胞進行細胞增殖能力的測定，用0.25%的胰蛋白酶消化人臍帶間充質干細胞，離心后去上清。

（2）加入含體積分數10%的胎牛血清的 DMEM 培養液使細胞重懸，調整細胞濃度至1x105個細胞/ml，固定于體積分數為70%冷乙醇中，4 ℃過夜后，用于流式細胞儀進行細胞表面標志的測定。

（3）細胞分別與鼠抗人的FITC-CD90、PE-CD86 、FITC-CD45 、PE-CD19 、FITC-CD105 、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗體反應，在 4 ℃的暗室中放置30 min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1為平行對照。數據用Cell Quest軟件處理。

2.4多項分化能力的檢測

（1）取培養的第4代人臍帶間充質干細胞分別進行成骨、成脂、成軟骨方向的誘導鑒定。

3.定向分化研究進展【10】

目前國內外文獻中記載的由人臍帶華通氏膠間充質干細胞定向分化成的細胞種類已達 18 余種。在近 5 年的文獻報道中，一部分研究改進了之前的誘導方法；另一部分研究開拓了人臍帶華通氏膠間充質干細胞定向分化的新方向；還有部分研究初步探索了分化過程中涉及的信號通路及相關的分子機制。

4.參考文獻

【1】Gardner OF, Alini M, Stoddart MJ. Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Bone Marrow. Methods Mol Biol. 2015;1340:41-52.

【2】Chong PP, Selvaratnam L, Abbas AA, Kamarul T. Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2012 Apr;30(4):634-42

【3】Doornaert M, De Maere E, Colle J, Declercq H, Taminau J, Lemeire K, Berx G, Blondeel P. Xenogen-free isolation and culture of human adipose mesenchymal stem cells. Stem Cell Res. 2019 Oct;40:101532.

【4】Hendrijantini N, Hartono P. Phenotype Characteristics and Osteogenic Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells Derived from Amnion Membrane (HAMSCs) and Umbilical Cord (HUC-MSCs). Acta Inform Med. 2019 Jun;27(2):72-77.

【5】Thaweesapphithak S, Tantrawatpan C, Kheolamai P, Tantikanlayaporn D, Manochantr S. The Biological Characteristics of Placenta Derived Mesenchymal Stem Cells Cultured in Human Serum. J Med Assoc Thai. 2016 Jul;99 Suppl 4:S75-83. PMID: 29917345.

【6】Tsai AI, Hong HH, Lin WR, Fu JF, Chang CC, Wang IK, Huang WH, Weng CH, Hsu CW, Yen TH. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Deciduous Teeth Pulp. Biomed Res Int. 2017;2017:2851906.

【7】Mushahary D, Spittler A, Kasper C, Weber V, Charwat V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 2018 Jan;93(1):19-31.

【8】陳鳳,楊敏,李彥潔,等.人臍帶間充質干細胞的分離培養及多向分化潛能研究[J].生物學雜志, 2021.

【9】王菲,周洪,郭昱成,et al.原代人臍帶間充質干細胞培養方法的研究[J].中國組織工程研究, 2014, 18(19):6.

【10】施沁,楊曉清,張玉泉,等.人臍帶華通氏膠間充質干細胞定向分化:現狀與前景[J].中國組織工程研究, 2018.