英文標題：

Puerarin Delays Mammary Gland Aging by Regulating Gut Microbiota and Inhibiting the p38MAPK Signaling Pathway

1.摘要：

培養細胞：小鼠乳腺上皮細胞（mMECs）

培養效果：使用BS-1105產品培養的細胞生長狀態良好

2.前言

乳腺組織對人類和動物的哺乳至關重要，健康的乳腺可以為后代提供高質量的哺乳，維持其健康發育。有研究表明，乳腺衰老可能與乳腺癌的發生發展密切相關。長期慢性炎癥反應可能改變乳腺內環境，引發細胞形態和功能的改變，甚至致癌突變。在生產動物中，乳腺衰老可能導致產奶量和泌乳壽命降低。衰老是細胞應激反應，分為生理性和病理性衰老。細胞衰老是衰老的重要標志，炎癥和氧化應激是導致細胞衰老的重要因素。衰老細胞分泌的SASP會改變周圍微環境，激活p38MAPK、NF-κB和mTOR信號通路，加速細胞衰老。相關研究也表明，腸道菌群在組織器官衰老中起重要作用，可以通過調節腸道微生物群的豐度來逆轉腸道和大腦的衰老。葛根素是一種從葛根中提取的異黃酮物質，具有抗炎、抗氧化等藥理作用。研究發現，葛根素可能通過調節腸道菌群和改善腸道菌群代謝產物，以及直接作用于乳腺組織，抑制p38MAPK信號通路，來延緩乳腺衰老。本研究首次發現葛根素可以通過p38MAPK-線粒體途徑直接對乳腺組織產生抗衰老作用，并通過調節腸道菌群抑制乳腺中p38MAPK的激活，從而延緩乳腺衰老。

3.結果與討論

3.2葛根素延緩慢性炎癥性乳腺衰老

慢性炎癥通過氧化損傷、DNA損傷和干細胞衰老加速衰老過程。在LPS誘導的乳腺組織衰老模型中，SA-β-gal活性升高，而葛根素能夠降低這種活性，表明葛根素可能具有抗衰老作用。葛根素處理能夠降低MDA（丙二醛）水平，同時提高SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）和GSH（谷胱甘肽）水平，表明葛根素具有減輕氧化應激的能力。葛根素下調了SASP基因中IL-1β、TNFα、IL-6、CXCL1、CXCL5和CXCL9的mRNA水平，這進一步支持了葛根素的抗炎和抗衰老作用。葛根素處理顯著下調了p53、p21和p16蛋白水平，這些蛋白是細胞衰老的標記物。葛根素顯示出延緩乳腺衰老的藥理作用，通過降低氧化應激和炎癥反應，以及調節與衰老相關的蛋白表達。

3.3. 葛根素在乳腺衰老過程中保護血-乳屏障的完整性

血腦屏障的破壞是衰老過程中主要的病理變化之一血-乳屏障也是抵抗病原體侵襲、維持乳腺微環境平衡的重要生物屏障，在乳腺衰老過程中也可能遭到破壞，通過研究葛根素對乳腺衰老過程中血-乳屏障的影響，實驗結果表明，葛根素能夠減輕FITC白蛋白滲透，能夠顯著促進Claudin3、Occludin和ZO-1的蛋白水平的表達，從而保護血-乳屏障。葛根素能夠逆轉LPS引起的緊密連接蛋白表達下調和分布異常，改善乳腺卵泡腔內緊密連接蛋白的分散和不規則分布。綜上所述，葛根素可以通過促進緊密連接蛋白的表達來修復乳腺衰老過程中血乳屏障的損傷。

3.4葛根素調節腸道微生物群

就微生物群、炎癥介質和免疫系統之間的相互作用而言，腸道微生物群的調節有助于促進生理和病理衰老過程，為了研究葛根素是否對腸道微生物群有調節作用，使用16S rRNA測序檢測小鼠糞便。為了評估葛根素對腸道菌群豐富度和物種多樣性的影響，我們分析了α多樣性。結果表明，葛根素處理可以增加微生物群落的豐度和多樣性。使用β-多樣性分析來評估各組之間腸道微生物群組成和分布的差異。結果顯示，LPS組小鼠的腸道微生物群與對照組明顯不同，而葛根素減輕了LPS誘導的這種轉變。隨后，在門、科和屬水平上分析了三組之間腸道微生物群物種豐度的差異。結果表明，葛根素可能通過調節腸道菌群來延緩慢性炎癥反應誘導的乳腺衰老。

3.5 葛根素通過調節腸道微生物群延緩乳腺衰老。

為了進一步研究葛根素是否通過調節腸道微生物群來延緩乳腺衰老，我們在小鼠中去除腸道微生物群后進行了FMT（圖4A）。結果表明，葛根素處理組的SA-β-gal，SASP基因mRNA水平和p53、p21、p16蛋白水平降低，發現p38MAPK激活在細胞衰老中起著重要作用。因此，進一步研究乳腺衰老過程中腸道菌群對p38MAPK激活的影響。結果顯示，葛根素處理組p38MAPK的磷酸化水平明顯降低，表明葛根素可能通過腸道菌群抑制p38MAPK的激活，從而延緩乳腺衰老。通過對衰老相關指標的檢測。結果顯示，與LPS組相比，乳酸、醋酸鈉和丙酸鈉處理的mMECs能夠顯著降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平以及SASP基因mRNA水平。這些結果表明，葛根素可能通過腸道菌群的相關代謝物延緩乳腺衰老。

3.6葛根素抑制乳腺衰老過程中MAPK信號通路的激活

為了進一步探討葛根素延緩小鼠乳腺衰老的作用機制，我們采用網絡藥理學方法預測葛根素延緩乳腺衰老的作用靶點和信號通路，發現葛根素與疾病共有30個共同靶點，核心靶點包括TP53（p53）、TNF、PPARG（PPAR-γ）、IL2、IL-1a、EGFR和ITGAM。GO分析篩選出與葛根素相關的10種生物、細胞和分子功能，涉及急性炎癥反應、炎癥反應調節、神經元凋亡過程的正調控，以及免疫系統過程、轉錄后基因沉默和RNA-to-gene沉默的負調控。KEGG富集分析顯示，JAKSTAT信號通路、MAPK信號通路、亞麻酸代謝等顯著富集。結合網絡藥理學結果，探討葛根素對乳腺衰老過程中MAPK信號通路的影響。結果顯示，與LPS組相比，葛根素顯著下調了ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK的磷酸化水平。上述結果提示葛根素可以抑制乳腺衰老過程中MAPK信號通路的激活。

3.7葛根素延緩LPS誘導的mMES細胞衰老

為了進一步探討葛根素在mMECs細胞衰老中的作用，在體外用LPS處理mMECs。結果顯示，p53、p21和p16的表達在36和48 h時顯著升高，其中在36 h時尤為顯著。葛根素在0-150 μM濃度下對mMECs細胞活力無影響，表明安全。150μM葛根素處理能顯著降低p53、p21和p16的表達，表明其可能延緩細胞衰老。葛根素能降低LPS誘導的炎癥反應，減少iNOS和COX-2的表達。降低SA-β-gal活性，下調MDA水平，上調SOD、CAT、GSH水平，降低SASP基因中炎癥因子的mRNA水平，表明其抗炎和抗衰老作用。為了進一步探討葛根素是否可以延緩炎癥反應誘導的細胞衰老，我們檢測了衰老相關指標的變化。結果顯示，葛根素可以降低SA-β-gal活性，下調MDA水平，上調SOD、CAT、GSH水平，降低SASP基因中炎癥因子的mRNA水平，表明其抗炎和抗衰老作用，為進一步明確葛根素對mMECs細胞衰老的影響，我們檢測了p53、p21和p16的表達水平。結果顯示，葛根素處理可顯著下調p53、p21和p16的表達。綜上所述，葛根素可以延緩LSP誘導的mMECs細胞衰老。

3.8葛根素主要抑制p38MAPK磷酸化延緩mMES衰老

已經證明葛根素可以抑制乳腺衰老中MAPK信號通路的激活，為了進一步闡明葛根素是通過抑制MAPK信號通路的激活來發揮其抗衰老作用，我們在體外進行了驗證。葛根素顯著下調了ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平。使用GDC-0994、SP600125和SB203850分別抑制ERK、JNK和p38活性后，這些抑制劑均能降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平，其中SB203850的效果最為顯著。因此，p38MAPK磷酸化在促進mMES細胞衰老過程中起著重要作用。模擬葛根素與p38蛋白之間的分子對接，結果顯示葛根素與p38蛋白之間的結合能量具有統計學意義，表明葛根素可能直接作用于p38MAPK。激活p38MAPK后，葛根素處理能夠降低SA-β-gal活性和p53、p21、p16蛋白水平。綜上所述，葛根素主要通過抑制p38MAPK的磷酸化來延緩mMES的細胞衰老。

3.9葛根素通過靶向p38MAPK改善mMES細胞衰老中的線粒體功能障礙

線粒體功能障礙和細胞衰老都是衰老的標志，兩者密切相關因此，為進一步探討了葛根素對mMES細胞衰老條件下線粒體功能的影響，檢測線粒體ROS （mtROS）和線粒體膜電位（MMP）的水平。結果表明，綜上所述，葛根素能夠通過靶向p38MAPK促進MFN1的表達，改善mMECs細胞衰老過程中的線粒體功能障礙。

4.結論

葛根素可能通過直接作用于乳腺組織而起到延緩衰老的作用。這可以通過靶向mMEC中的p38MAPK線粒體途徑來實現。此外，葛根素可以調節腸道菌群組成，促進有益菌定植，促進乳酸、乙酸、丙酸的產生，通過血液循環進入乳腺，起到抗衰老的作用。