英文標題：

An Antibacterial Bionic Periosteum with Angiogenesis Neurogenesis Coupling Effect for Bone Regeneration

使用產品：BS-1105

培養細胞：骨髓間充質干細胞

培養效果：良好

摘要：

骨膜富含神經血管網、骨祖細胞和干細胞，對骨修復至關重要。目前人工骨膜材料在機械強度、細菌感染、促進成骨分化和血管生成等方面面臨挑戰。為了解決這些問題，我們調整了聚ε-己內酯和殼聚糖的靜電紡絲比例，并將鋅摻雜的白磷鈣石和聚多巴胺涂層加入到納米纖維膜中。經過一系列表征，聚己內酯與殼聚糖的比例為8:1，納米粒含量為5%時獲得了最優的結果。在體外細胞實驗和體內顱骨缺損模型中，Mg2+和Ca2+的持續釋放分別促進血管化和新骨形成，而Zn2+的釋放有利于抗菌，并與Mg2+協同促進神經血管化。因此，這種具有血管生成-神經生成耦合效應的抗菌仿生骨膜在骨修復方面具有良好的應用前景。

前言：

骨膜在骨修復和再生中扮演著關鍵角色，但在傳統骨修復材料設計中常被忽視。骨膜通過提供營養、保護和干細胞調節來促進骨骼生長和愈合。臨床研究顯示，骨膜損傷會影響骨移植的營養供應，而保留骨膜則有助于骨再生。異體骨膜的應用受到免疫排斥、二次損傷和供體不可用性的限制。仿生骨膜因其結構和功能與自然骨膜相似，成為治療骨缺損的潛在選擇。組織工程骨膜雖能促進骨再生，但存在病毒感染和細胞存活問題。無需細胞加載的仿生骨膜可能是一種更簡單的修復策略。靜電紡絲技術用于制備多孔可生物降解聚合物纖維膜，模仿骨膜結構以促進干細胞功能。聚己內酯（PCL）和殼聚糖（CS）是常用于靜電紡絲的生物材料，但各有優缺點。CS具有抗菌性，而PCL具有良好的生物相容性和機械性能。聚苯胺-殼聚糖復合納米纖維膜能刺激細胞形成，但骨再生還需添加生物活性礦物。羥基磷灰石（WH）作為骨移植替代品，能釋放促進骨再生的離子。聚多巴胺（PDA）促進細胞粘附和骨分化。研究構建了PCL/CS/PDA@Zn-WH復合人工骨膜，發現其在體外和體內實驗中均顯示出優異的成骨誘導能力和促進早期神經血管化，為生物材料設計提供了新見解。

結果與討論：

1、聚己內酯和殼聚糖不同比例的形態學和機械性

通過將殼聚糖與聚己內酯（PCL）混合來改善殼聚糖的可紡性，并研究了混合比例對納米纖維結構和物理化學性質的影響。研究發現，隨著殼聚糖含量的增加，納米纖維的直徑減小，表面張力增加，需要更高的電場力來形成纖維。殼聚糖的增加導致納米纖維膜斷裂時的應變降低，但由于氫鍵作用，拉伸應力增加。在不影響斷裂伸長的前提下，PCL與CS比例為8:1時展現出最佳的機械性能。親水性測試顯示，增加CS比例可以增強膜的親水性，使膜從疏水性轉變為親水性。最終，研究選擇了PCL:CS = 8:1的比例進行后續實驗。

2、納米顆粒的表征

通過水熱法成功合成了Zn-WH（摻雜鋅的白鎢礦）和WH（白鎢礦），并通過X射線衍射（XRD）和X射線光電子能譜（XPS）分析確認了Zn-WH的晶體相和元素組成。Zn2+摻雜未改變WH的晶體結構，XPS分析顯示Zn、Ca、Mg、P和O的特定含量。為了增強Zn-WH的粘附性、成骨和血管生成能力，使用聚多巴胺（PDA）對Zn-WH進行了表面修飾，并通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）證實了PDA的成功修飾。掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）分析顯示，PDA修飾后的PDA@Zn-WH粒徑平均為168納米，聚多巴胺層厚度約為10納米，且納米粒子尺寸未有明顯變化。能量色散X射線光譜（EDS）分析進一步確認了納米粒子中元素的均勻分布。

3、不同納米顆粒含量的納米纖維膜的物理和化學性質

研究探討了不同重量的納米顆粒摻雜對納米纖維膜的影響。SEM分析顯示，摻雜納米顆粒增加并未改變纖維直徑，保持在約250納米，表明納米顆粒的加入未影響紡絲溶液的表面張力。隨著納米顆粒含量的增加，膜的拉伸強度先增后減，在5%含量時達到最大值，歸因于納米纖維與納米顆粒間的氫鍵相互作用。超過5%后，機械性能下降，可能是由于應力集中。TG分析確認了復合納米纖維膜中納米顆粒的最佳含量為5%，TEM分析顯示納米顆粒在納米纖維膜中均勻分布。

4、抗菌特性

在骨科植入物設計中，抗菌特性至關重要，因為植入物相關感染可能導致嚴重并發癥，降低患者生活質量。本研究通過金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落形成單位（CFU）測定法評估了不同納米纖維膜的抗菌特性。結果顯示，殼聚糖（CS）組對這兩種細菌表現出輕微抗菌性，但由于CS的正電荷與細菌細胞膜的負電荷相互作用，破壞了細胞膜結構，抗菌效果較弱。當納米纖維膜中加入Zn-WH或PDA@Zn-WH納米顆粒時，抗菌性能顯著提高，因為這些納米顆粒能釋放Zn2+，實現高效抗菌。兩組的殺菌率均超過99%，表明PCL/CS/Zn-WH納米纖維膜能持續釋放Zn2+，有效消毒，防止植入物感染，為骨修復提供一個無菌環境。

5、材料的生物相容性

Zn2+在骨科植入物中具有重要作用，高濃度Zn2+雖然具有強殺菌效果，但也可能帶來細胞毒性。摻雜5% Zn-WH和PDA@Zn-WH的納米纖維膜展現出顯著的物理化學特性和抗菌性能。通過骨髓間充質干細胞（BMSCs）和內皮前體細胞（EPCs）的粘附和增殖來評估不同納米纖維膜的生物相容性。結果顯示，含有PDA@Zn-WH的納米纖維膜更有利于細胞生長和增殖，從而提高了其作為骨科植入物的潛力。

6、神經發生特性

文章探討了神經纖維在骨骼結構中的作用，以及骨內神經對骨代謝的調節作用。神經遞質和神經肽等由周圍神經分泌的物質對骨形成和修復至關重要。研究表明，含有感覺神經纖維的組織工程骨能成功修復大型骨缺損，且植入合作感覺神經纖維的組織工程骨在成骨方面更優。此外，鎂合金也能通過促進神經肽分泌來促進骨再生。研究還評估了納米纖維膜對神經細胞（RSCs和PC-12細胞）的生物相容性和神經發生的影響。結果表明，PDA@Zn-WH組可以通過持續釋放Zn2+和Mg2+來促進骨缺損區域的神經再生。

7、成骨分化和血管化特性

人類骨骼組織遍布神經纖維，這些纖維在骨代謝中起調節作用，尤其在代謝活躍區域。研究表明，含有感覺神經纖維的組織工程骨在修復大型骨缺損時效果更佳。骨膜中的血管網絡對骨修復至關重要，需要誘導血管生成和成骨分化。Ca2+、Mg2+和PO43?在干細胞增殖和分化中起關鍵作用，促進成骨分化和礦化。通過染色檢測發現Zn-WH組和PDA@Zn-WH組在成骨誘導方面表現優于PCL和CS組，I型膠原蛋白和鈣結節含量顯著更高。Zn2+和Mg2+通過MAPK/ERK信號通路促進間充質干細胞成骨分化。管腔形成實驗顯示，Zn-WH和PDA@Zn-WH組的血管生成誘導能力優于PCL和CS組，PDA@Zn-WH組表現最佳。Zn-WH和PDA@Zn-WH組對EPC遷移的促進效果也更強，表明它們具有強大的血管生成誘導能力。因此，添加Zn-WH納米顆粒能顯著增強仿生骨膜的成骨和血管生成誘導性能，PDA@Zn-WH紡絲膜有望通過“成骨-血管化”耦合效應實現更好的成骨修復效果。

8、體內成骨和神經血管化

本研究探討了在骨骼再生中重建神經血管化網絡的重要性，并驗證了納米纖維膜在促進神經血管化方面的效果。通過在SD大鼠顱骨缺損模型中植入納米纖維膜，并在術后第七天進行免疫熒光染色，評估了神經修復和血管生成效果。結果顯示，PDA@Zn-WH組在CD31和β3-微管蛋白表達上高于其他組，表明其在神經血管化方面效果最佳。3D重建顯示PDA@Zn-WH組修復效果顯著，優于其他組。骨體積分數（BV/TV）分析也顯示PDA@Zn-WH組骨生成效果最高，且高于Zn-WH組，表明PDA促進新骨生長。組織學檢查進一步確認了這些發現，PCL/CS/PDA@Zn-WH組硬組織面積最大。ICP分析結果顯示PCL/CS/PDA@Zn-WH組釋放更多Ca2+和Mg2+，促進骨組織再生。這些結果表明，PDA@Zn-WH納米纖維膜通過“成骨-血管化”耦合效應，有效促進了骨缺損區域的神經血管化和骨再生。

結論：

本研究成功開發了一種具有良好細胞相容性的成骨誘導納米纖維膜，能夠有效促進骨再生。首先優化了PCL和CS的比例以獲得最佳的物理性能，隨后評估了不同量的Zn-WH或PDA@Zn-WH摻雜對物理性能的影響，并選擇了最佳組進行生物學評估。抗菌性測試顯示PCL/CS/PDA@Zn-WH組對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抗菌效果。體外實驗結果表明，PCL/CS/PDA@Zn-WH組在成骨和神經血管化方面潛力最大。體內實驗通過H&E和Masson染色進一步證實了該組在成骨和神經血管化方面的效果優于其他組。因此，PCL/CS/PDA@Zn-WH納米纖維膜作為一種仿生骨膜，對于臨床治療骨缺損和促進骨再生顯示出巨大的潛力。